Institut de recherche biomédicale
     

    Fixation

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    Les principes de la fixation en microscopie électronique.

     

        La fixation chimique consiste à reconstituer artificiellement le gel protéique du vivant très hydraté (75% à 95% d'eau) afin de rendre les molécules d'un échantillon insolubles dans l'eau comme dans les solvants organiques, et ainsi bloquer les systèmes enzymatiques pour éviter toute modification structurelle ultérieure de l'échantillon. En effet, l'échelle très fine à laquelle se font les observations en microscopie électronique impose de conserver, sans modification, les structures correspondant à l'état vivant.

        Le glutaraldéhyde (COH(CH2)3COH) est un dialdéhyde qui interagit rapidement avec les protéines. Il stabilise les structures en créant des ponts artificiels entre les protéines et des groupements animés libres: Avec deux groupes aldéhydes séparés par une chaîne flexible, HCO-(CH2)3-CHO, il possède un grand potentiel de création de ponts, qui peuvent apparaître grâce aux deux groupes et à des distances variables. Certaines substances tel le glycogène ou la matrice extracellulaire sont ainsi préservées. Néanmoins le glutaraldéhyde seul reste insuffisant et il est nécessaire de réaliser une seconde fixation au tetroxide d'osmium pour éviter l'extraction de certains composants lors de la déshydratation (en particulier les lipides). Cette étape doit cependant être limité au minimum, car l'osmium peut entraîner l'extraction de certaines protéines.

        Si le glutaraldéhyde agit rapidement, c'est un fixateur de pénétration assez lente, 1 mm par heure maximum (à cause de la taille encore relativement importante des oligomères). Pour certains tissus, notamment la peau, il est nécessaire de fixer deux heures des échantillons d'une épaisseur inférieure à 0,5mm.

        Il est très important pour nos technique d'utiliser un glutaraldéhyde "EM grade", qui est composé uniquement de monomères, les seuls de taille suffisamment réduite pour pénétrer rapidement le tissus (les autres formules sont destinées à tanner le cuir !)

    La fixation par le glutaraldéhyde peut entraîner certaines difficultés :

    • Il y a création de groupes aldéhydes libres (et qui ne peuvent pas être éliminés par les lavages) qui peuvent provoquer des fixation non spécifiques d'anticorps.
    • Les ponts induits par la glutaraldéhyde ne permettent pas la pénétration de la parafine, il est obligatoire d'utiliser des polymères de plastiques, ou de la résine, pour réaliser l'inclusion.
    • Cette fixation gêne considérablement les marquages immunologiques qui demandent le plus grand nombre possible de chaîne d'acides aminés intactes. La majorité des réactions enzymatiques sont aussi détruites, bien que certaines soient encore possibles après une fixation rapide.


        Le paraformaldéhyde, monoaldéhyde (il s'agit en fait d'un polymère insoluble de formaldéhyde , qui donne des monomères de formaldéhyde quant il est dissous dans le tampon) de formule (CH2)n, est en revanche un fixateur de pénétration rapide (grâce aux petites molécules de HCHO), environ 10 mm par heure. Le groupe aldéhyde -CHO se combine avec les atomes d'azote des protéines. Il met cependant plus de temps pour stabiliser les structures que le glutaraldéhyde. La fixation est donc moins efficace et l'ultrastructure moins bien préservée pour l'observation morphologique.

     

        Le Karnovsky : Un mélange des deux fixateurs est la meilleure fixation dans certains cas: échantillons de grande taille (sachant que dans ce cas il y aura quand même une fixation de moins bonne qualité au centre de l'échantillon), échantillon très dense (cas de la peau) ou besoin d'un marquage immunologique ultérieur. Le paraformaldéhyde pénètre rapidement le tissus et stabilise légèrement les protéines qui sont ensuite fixées de façon permanente par le glutaraldéhyde.Le mélange le plus utilisé en microscopie électronique est associé au nom de Morris J. Karnovsky, la technique ayant été publiée d'abord dans un abstract non référencé (Karnovsky, 1965): 2,5% glutaraldéhyde, 4% paraformaldéhyde en tampon cacodylate 0,1M.