Déroulement pratique d'un projet
La réunion préalable.
Une réunion préalable permet de définir avec précision les demandes, les question auxquelles il faudra répondre, les protocoles utilisés, etc. Elle permettra aussi un premier contact avec la microscopie électronique pour ceux qui ne connaissent pas la technique. Une planification est réalisée en ce qui concerne la première série d'échantillon et/ou pour une formation.
La préparation de l'échantillon
Avis important: les utilisateurs sont tenus de fixer eux-même leur matériel biologique, pour des raisons de sécurité (sauf expériences particulières comme les dépôt en vue de contraste négatif).
- L'échantillon à étudier est facilement déplaçable après fixation, et prêt pour le processus de microscopie électronique.
- Une fixation immédiate et rapide est indispensable à la préservation de l'ultrastructure cellulaire, et donc à une observation en microscopie électronique.
- La fixation nous permet de travailler sur tous les types de matériels biologiques sans restriction de confinement.
La Plate-forme de microscopie électronique se réserve le droit de refuser de travailler avec des échantillons qui n'auront pas été traités suivant les protocoles donnés (il en est de même pour les échantillons qui nous seront proposés à d’autres étapes plus avancées, c’est à dire déjà inclus, coupés et colorés).
Les étapes initiales sont primordiales à l'obtention de résultats exploitables et les erreurs commises à ce moment précis sont difficilement corrigées. L'orientation, la taille et la quantité sont des paramètres particulièrement critiques et à surveiller.
Protocoles de fixation (spécifiques de la microscopie électronique)
Ci-dessous sont résumées les méthodes de fixation les plus utilisées:
- Pour une étude morphologique :
- 1 heure dans le glutaraldéhyde 3% dilué en tampon phosphate 0,1M, à température ambiante.
Pour un marquage immunologique sur cellules congelées, il y a deux protocoles possibles:
- Soit 1 heure dans le glutaraldéhyde 1% dilué en tampon phosphate 0,1M, à température ambiante
- Soit 1 heure en PFA 4% + 0,2% glutaraldéhyde dilué en tampon phosphate 0,1M, à température ambiante.
Le choix entre ces deux méthodes s'effectuera en fonction de la sensibilité des anticorps. L'utilisation de PFA entraine une moins bonne morphologie mais va mieux préserver les antigènes et donc la sensibilité du marquage pour certains anticorps.
Les conditions d'accès
Le microscope électronique est accessible du lundi au vendredi sur rendez-vous. Les créneaux d'observation sont habituellement de 10h à 12h30 et de 14h à 17h30.
Le travail d'observation et de prise de vue s'effectue en compagnie de l'ingénieur responsable, qui manipule le microscope ou en autonomie après formation.
Les formations
Nous prodiguons une formation pour chaque étape de nos prestations. Cela est destiné aux projets se déroulant sur une durée longue ou avec un nombre important d'échantillons.
- Formation des utilisateurs aux différents équipements disponibles
- Formation aux techniques de préparation des échantillons :
- déshydratation,
- inclusion (résines époxy ou congélation),
- immunocytochimie en pré et post-inclusion : mise en évidence de protéines, marquage à la peroxydase ou à l'or colloïdal
- coupes ultra fines
- colorations
- observation
- acquisition
Acquisition et traitement des données
Les acquisitions se présentent sous la forme d'un image au format dm4, qui est le format propriétaire du logiciel d'acquisition. Ce format permet la conservation des données de fonctionnement du microscope pendant l'observation, ainsi que d'analyser les images à l'aide de Digital Micrograph et dans une certains mesure d'ImageJ. Le logiciel Digital Micrograph est disponible gratuitement sur le site du fabricant de nos caméras d'acquisition. Il demande juste une inscription pour être utilisé. http://www.gatan.com/products/tem-analysis/gatan-microscopy-suite-software
Les données peuvent être converties au format Tiff après l'acquisition et les collaborateurs peuvent les récupérer immédiatement. Elles peuvent être aussi converties en JPEG, mais il s'agit d'un format de compression destructif et donc il y a perte d'information.
Le moyen le plus pratique est d'apporter au moment de l'observation une clef USB ou un disque dur externe. Il est difficile de prévoir la taille des données recueillies mais il n'est pas rare que dépasser le gigaoctet d'image.
Nous conservons les acquisitions de notre coté, mais en l'absence de solution de stockage décentralisée sur la plateforme, nous ne pouvons garantir à 100% cette conservation.
