Les protocoles pour la plateforme PIME

La préparation d'un échantillon biologique en vue d'une étude en microscopie électronique à transmission requiert un traitement spécifique. Des cellules issues d'une culture en milieu liquide ne seront pas préparées de la même façon que des cellules cultivées sur filtre ou qu'un tissu animal.

D'autres facteurs entrent en ligne de compte, comme la nécessité ou non de réaliser un marquage immunologique, ou de rechercher une structure particulière.

  • 1ère étape : isolement et fixation
  • 2ème étape : inclusion : le matériel est déshydraté, puis inclus selon diverses techniques
  • 3ème étape : coupe ultra-fine
  • Etape immunologique : marquage à l'or pour la localisation ultrastructurale des protéines
  • Dernière étape : observation et photographie.
Image de microscopie électronique

Tampons et fixateurs

La préparation du matériel biologique en vue d'une étude en microscopie électronique comporte deux phases: l'isolement et la fixation. Ces phases demandent l'utilisation d'un tampon précis, tampon cacodylate ou tampon phosphate. Si le tampon cacodylate était traditionnellement le plus utilisé, le tampon phosphate est aussi efficace et beaucoup moins dangereux pour le manipulateur.

Tampon cacodylate 0,1M pH 7,4

  • Cacodylate de sodium (CH3)2AsO2Na3H2O, pm 214,05 : 2,14g dans 50 ml d'eau distillée, auquel on ajoute 2,7 ml de HCl 0,2N.  Le tampon cacodylate 0,2M est dilué volume à volume dans l'eau distillée pour obtenir le tampon cacodylate 0,1M pH 7,2

Tampon phosphate 0,1M pH 7,2

  • Phosphate monosodique 0,2M: NaH2PO4, 2H2O: pm= 156. Peser 7,8g pour 250 ml
  • Phosphate disodique 0,2M: Na2HPO4, 2H2O: pm= 178. Peser 17,8g pour 500ml

Le tampon phosphate 0,2M est obtenu par mélange de 11ml de phosphate monosodique 0,2M et 39 ml de phosphate disodique 0,2M. Il est dilué volume à volume dans l'eau distillée pour obtenir le tampon phosphate 0,1M pH 7,2.

Isolement

TRES IMPORTANT:
 Le traitement des cellules ou le prélèvement du tissu à étudier doit être le plus rapide possible afin d'éviter la dégradation de la morphologie.
Les échantillons doivent être de petite taille : au maximum 1mm d'épaisseur.
La zone à étudier doit être repérée et isolée dés le début du processus.

 

 Virus et structures isolées

La suspension virale, ou une solution contenant la structure à étudier (lysat de mitochondries, exosomes, etc.) est déposé quelques minutes sur une grille spécialement préparée (recouverte d'un film de formwar sur lequel nous avons pulvérisé du carbone). La grille est séchée sur la tranche. Après trois lavages la grille est colorée par les techniques de coloration négative, et prête pour l'observation. Cette technique permet aussi de réaliser des marquages immunologiques.

Cellules isolées

     L'étude de cellules isolées ne pose pas de problème si on respecte quelques règles simples:

  • Une quantité minimale : 1à 10 millions de cellules, cela va dépendre de la taille des cellules. Le culot doit être impérativement d'au moins un millimètre au fond d'un eppendorf pour être exploitable en microscopie électronique, et attention aux pertes pendant les lavages. certaines cellules peuvent coller aux parois.
  • Attention à ne pas activer les cellules "sensibles" (cas des plaquettes sanguines par exemple)
  • La fixation s'effectue dans au moins 1ml de fixateur, 1heure à température ambiante.
  • 3 lavages sont nécessaires, par cycles de centrifugation.
  • Dans les cas des cellules issues de culture, il est primordial de laver les cellules en milieu sans sérum avant fixation. Sans cela il y a risque de précipitation des protéines du milieu de culture.
  • Le culot ne doit JAMAIS être sec.

Le cas particulier des cellules adhérentes peut poser problème: les méthodes de décollement, trypsine ou grattage, sont susceptible d'abimer les cellules, ainsi que de diminuer le marquage de la membrane. Dans ce cas il n'y a pas de véritable bonne solution, et il est nécessaire de tester les différents protocoles pour trouver le moins destructeur. Après décollement, le protocole est le même que pour les cellules isolées.

Il existe néanmoins une solution, qui permet de répondre aussi au problème de cellules disponibles en petites quantités: il s'agit de déposer les cellules sur des lamelles de verre, et de réaliser l'inclusion sur ce support. L'échantillon sera alors inclus en monocouche en résine. Cette technique permet donc d'étudier la morphologie de cellules rares et/ou accrochée à un substrat (verre, plastique, d'autres cellules, filtre) et de réaliser des marquages avant inclusion.

Il faut savoir aussi qu'il y a toujours le risque de perdre des cellules au fur et à mesure de l'inclusion. Il est donc aussi pour cela important d'avoir une bonne quantité de matériel au départ ainsi que de choisir des tubes qui ne retiennent pas les cellules.

Tissus

Le premier facteur clef de l'isolement des tissus est la rapidité. plus vite l'échantillon sera dans le fixateur, meilleure sera la préservation de son ultrastructure.

Le deuxième facteur important est la taille de l'échantillon. Pour des raisons inhérentes à la technique (en particulier la nature des fixateurs chimiques utilisés et la taille des outils de coupe et d'observation), la taille en est obligatoirement réduite pour la microscopie électronique. Dans une de ces dimensions le fragment de tissus doit être inférieur à 1mm. Dans le cas d'un échantillons trop épais, les zones situées en profondeur ne seront pas fixées et la morphologie en sera fortement dégradée.

Le troisième point est d'avoir une réflexion préalable sur le but de l'étude en microscopie électronique. En effet, la contrepartie à un grossissement qui va de X3000 à X80000 est une zone observable réduite en surface. Il sera possible de voir la structure des organites, l'état du noyau, les membranes, voire de grosses macromolécules, mais impossible d'étudier un échantillon au niveau tissulaire. Il faut donc dés le prélèvement penser à repérer la zone intéressante pour l'isoler et ainsi faciliter et accélérer l'étude. En bref, il vaut mieux la chercher maintenant qu'au moment de la coupe ultrafine.

Un dernier point : dans certains cas, il peut être intéressant d'envisager une perfusion de l'animal entier avec le fixateur. Les tissus fragiles et/ou difficiles d'accès seront ainsi mieux préservés. Cette méthode est par exemple indispensable pour l'étude du cerveau, organe hétérogène, fragile et difficile d'accès.

     Protocole pour tissus:

  • Déterminer à l'avance la zone à étudier.
  • Prélever le tissus.
  • Dans le mesure du possible couper l'échantillon pour lui donner la taille idéale.
  • Le laisser une heure dans le fixateur à température ambiante.
  • Laver trois fois cinq minutes en tampon phosphate 0,1M
  • Si l'inclusion immédiate est impossible, l'échantillon peut attendre une nuit à 4°C dans le tampon.

Fixation

La fixation chimique consiste à reconstituer artificiellement le gel protéique du vivant très hydraté (75% à 95% d'eau) afin de rendre les molécules d'un échantillon insolubles dans l'eau comme dans les solvants organiques, et ainsi bloquer les systèmes enzymatiques pour éviter toute modification structurelle ultérieure de l'échantillon. En effet, l'échelle très fine à laquelle se font les observations en microscopie électronique impose de conserver, sans modification, les structures correspondant à l'état vivant.

Le glutaraldéhyde (COH(CH2)3COH)

est un dialdéhyde qui interagit rapidement avec les protéines. Il stabilise les structures en créant des ponts artificiels entre les protéines et des groupements animés libres: Avec deux groupes aldéhydes séparés par une chaîne flexible, HCO-(CH2)3-CHO, il possède un grand potentiel de création de ponts, qui peuvent apparaître grâce aux deux groupes et à des distances variables. Certaines substances tel le glycogène ou la matrice extracellulaire sont ainsi préservées. Néanmoins le glutaraldéhyde seul reste insuffisant et il est nécessaire de réaliser une seconde fixation au tetroxide d'osmium pour éviter l'extraction de certains composants lors de la déshydratation (en particulier les lipides). Cette étape doit cependant être limité au minimum, car l'osmium peut entraîner l'extraction de certaines protéines.

Si le glutaraldéhyde agit rapidement, c'est un fixateur de pénétration assez lente, 1 mm par heure maximum (à cause de la taille encore relativement importante des oligomères). Pour certains tissus, notamment la peau, il est nécessaire de fixer deux heures des échantillons d'une épaisseur inférieure à 0,5mm.

Il est très important pour nos technique d'utiliser un glutaraldéhyde "EM grade", qui est composé uniquement de monomères, les seuls de taille suffisamment réduite pour pénétrer rapidement le tissus (les autres formules sont destinées à tanner le cuir !)

La fixation par le glutaraldéhyde peut entraîner certaines difficultés :

  • Il y a création de groupes aldéhydes libres (et qui ne peuvent pas être éliminés par les lavages) qui peuvent provoquer des fixation non spécifiques d'anticorps.
  • Les ponts induits par la glutaraldéhyde ne permettent pas la pénétration de la parafine, il est obligatoire d'utiliser des polymères de plastiques, ou de la résine, pour réaliser l'inclusion.
  • Cette fixation gêne considérablement les marquages immunologiques qui demandent le plus grand nombre possible de chaîne d'acides aminés intactes. La majorité des réactions enzymatiques sont aussi détruites, bien que certaines soient encore possibles après une fixation rapide.

 

Le paraformaldéhyde, monoaldéhyde

Iil s'agit en fait d'un polymère insoluble de formaldéhyde , qui donne des monomères de formaldéhyde quant il est dissous dans le tampon. De formule (CH2)n, c'est en revanche un fixateur de pénétration rapide (grâce aux petites molécules de HCHO), environ 10 mm par heure. Le groupe aldéhyde -CHO se combine avec les atomes d'azote des protéines. Il met cependant plus de temps pour stabiliser les structures que le glutaraldéhyde. La fixation est donc moins efficace et l'ultrastructure moins bien préservée pour l'observation morphologique.

 Le Karnovsky

Un mélange des deux fixateurs est la meilleure fixation dans certains cas: échantillons de grande taille (sachant que dans ce cas il y aura quand même une fixation de moins bonne qualité au centre de l'échantillon), échantillon très dense (cas de la peau) ou besoin d'un marquage immunologique ultérieur. Le paraformaldéhyde pénètre rapidement le tissus et stabilise légèrement les protéines qui sont ensuite fixées de façon permanente par le glutaraldéhyde.Le mélange le plus utilisé en microscopie électronique est associé au nom de Morris J. Karnovsky, la technique ayant été publiée d'abord dans un abstract non référencé (Karnovsky, 1965): 2,5% glutaraldéhyde, 4% paraformaldéhyde en tampon cacodylate 0,1M.

Inclusion

Morphologie: inclusion en résine

Les coupes futures seront soumises à un rayonnement électronique assez puissant. Elles doivent êtres à la fois très résistantes à l'échauffement tout en restant suffisamment fines pour laisser passer le flux d'électron. Cet objectif est atteint grâce à l'emploi de résines synthétiques qui, après polymérisation, deviendront très rigides, avec un minimum d'altération de la structure du matériel biologique. Les résines les plus employées sont l'araldite et l'epon. C'est cette dernière qui est utilisée par la plate-forme.

 Après la fixation au glutaraldéhyde et/ou au paraformaldéhyde, l'échantillon est soigneusement lavé en tampon. Ensuite, il est possible de réaliser une coloration à l'acétate d'uranyl. Le cas échéant (voir section coloration), le lavage sera effectué à l'eau distillé.

 Les étapes suivantes consistent en la déshydratation de l'échantillon, qui s'effectue dans des bains successif d'éthanol 70%, 90% puis 100%. L'échantillon est ensuite plongé dans deux bains d'oxyde de propylène, puis dans un mélange prépolymère/oxyde de propylène. Le prépolymére d'epon est préparé à l'avance et stocké à -20°C. Dans le cas d'une inclusion dans un récipient en plastique, l'oxyde de propylène est remplacé par de l'éthanol.

Enfin le matériel est laissé dans le prépolymère pur, pour être inclus dans des capsules de gélatine. Les capsules sont mises à polymériser pendant 24 heures (minimum) dans une étuve à 60°C.

Immunologie: Congélation

La difficulté en microscopie électronique est de trouver l'équilibre entre préservation de la morphologie et protection des sites antigéniques, tout en produisant des coupes ultrafines qui résistent au flux d'électron.

Après fixation le matériel est repris dans de la gélatine à 10%, puis refroidit à 4°C. Ainsi inclus il est laissé au moins une nuit (plus pour du tissus) dans le PVP-sucrose. Enfin, coupé à la bonne dimension, l'échantillon est congelé dans l'azote liquide.

Coupe

Ultrastructure

Les coupes sont réalisées sur un ultramicrotome Reichert Ultracut S. Des coupes semi-fines sont efectuées pour contrôler la qualité et l'orientation de l'échantillon. Elles sont alors colorées au bleu de toluidine et peuvent être conservées  sur lame. Les coupes ultra-fines sont coupées avec un couteau de diamant (Diatome). Elles sont d'une épaisseur de 60 à 90 nm.

Immunologie

La coupe se déroule dans une chambe entourées d'une cuve d'azote liquide, qui permet de maintenir l'échantillon à -100°C. Les coupes ainsi réalisées doivent être utilisées au plus tard le lendemain. Une expérience de marquage en "cryo" prend donc deux jours pleins.

Image de microscopie électronique

Marquages immunologiques

Consultez-nous pour des :

  • Marquages simples
  • Doubles marquages.
  • Marquages avant inclusion (pré-embedding)

Observations et acquisitions

Dans l'état actuel de la plate-forme, l'observation s'effectue en compagnie de l'ingénieur responsable. Il s'agit d'une garantie de rapidité et de qualité des acquisitions.

L'objectif de l'observation est de répondre à la question posée, et ensuite de conserver les données. Une première observation prendra toujours un peu de temps, pour s'habituer à l'aspect des coupes de microscopie électroniques à transmission et leur interprétation. Une fois l'œil éduqué, et s'il y a un résultat significatif, vient l'étape de prise de vue.  Il s'agit alors de sélectionner les champs d'observation les plus utiles et les plus significatifs pour répondre à la question posée.

Les observations sont réalisée à l'aide d'une caméra GATAN eslangshen montée en port 35mm, donc en grand angle qui permet champ de vision large. Ainsi il est possible de balayer rapidement la grille est de trouver les points d'intérêt. Dans certains cas, nous avons besoin d'une plus grande résolution. Nous disposons d'une caméra GATAN Orius qui permet de monter dans les agrandissements et d'acquérir plus facilement les objets de petite taille.

Les acquisitions sont réalisées à partir du logiciel Digital Micrograph.

Acquisitions

Les acquisitions se présentent sous la forme de fichiers image au format dm3. Il s'agit du format du logiciel Digital Micrograph, qui ne peut être lu que par lui-même et un plug-in de imageJ.

Nous effectuons donc sur la plate-forme directement après l'acquisition  une conversion des images au format tiff. C'est à cette étape que le demandeur récupère ses données. Ces images sont en couleurs indexées, font environ 3400 pixels sur 2600 à la résolution de 72pixels/pouces. Elle pèsent entre 8,9 Mo et 10,4 suivant la caméra utilisée. Nous suggérons aux utilisateurs de conserver ces images ainsi, et de travailler sur des copies converti es en niveau de gris, en jpeg si besoin est. 

Ne pas oublier si vous voulez diminuer la taille des images sous photoshop ou the gimp d'augmenter la résolution en même temps sous peine de se retrouver avec quelques pixels à la fin. Par exemple, pour envoyer des photos par courriel, nous suggérons la manoeuvre suivante: Passer l'image en niveau de gris, monter la résolution en 300 pixels/pouce et en même temps diminuer la taille en 20 x15 cm. Enfin, enregistrer dans le format jpeg.

Nous assurons la conservations de toutes les acquisition réalisées sur la plate-forme, pour l'instant pendant 3 ans. Néanmoins, en raison de l'absence de la possibilité d'une sauvegarde en réseau, non ne pouvons absolument pas garantir cette sauvegarde. Chaque utilisateur est donc responsable de la sauvegarde de ses données une fois qu'il les a récupérées.