Régulation du transcriptome dans les cellules infectées par le VIH

En générant un panel d’isoformes d’ARNm, l’épissage alternatif est un moyen d’élargir et de réguler l’expression de la plupart des gènes cellulaires. Près d’un cinquième des maladies humaines seraient causées par un EA aberrant.

Avec un génome relativement court (9700 nt), le VIH-1 utilise l’épissage alternatif pour générer à partir d’un seul ARN pré-messager plus de 100 transcrits viraux différents. Impactant à la fois la production de l’ARN génomique (non épissé) et celui des ARNm codants l’ensemble des protéines virales requises pour la formation de nouveaux virus. Ce processus est fortement régulé au cours de l’infection et un déséquilibre peut avoir des effets délétères sur la réplication virale.

L’objectif de notre équipe est de caractériser plus précisément les mécanismes moléculaires impliqués dans ces étapes clés de la réplication du VIH-1. En particulier, notre travail vise à caractériser en détail la composition du transcriptome viral dans les cellules infectées, à définir comment il est modulé au cours de l’infection, à identifier les facteurs cellulaires et viraux qui sont impliqués et à explorer leurs impacts sur la réplication du virus.

 

Introduction

L’épissage est un processus catalytique orchestrée par le splicéosome, un large complexe ribonucléoprotéique qui s’assemble sur l’ARN pré-messager via la reconnaissance d’éléments de l’ARN spécifique dont le site donneur (SD) d’épissage en 5’ de l’intron et le site accepteur (SA) d’épissage en 3’ de l’intron et qui aboutit à l’excision de l’intron et la ligation d’exons.
Dans la plupart des souches du HIV, l’EA repose sur quatre sites donneurs majeurs (D1 à D4) et huit site accepteurs (A1, A2, A3, A4a, A4b, A4c, A5 et A7) et la compétition dans l’utilisation de ces sites d’épissage génère le panel des ARNm viraux. L’utilisation de deux sites d’épissage suboptimaux (D2 et D3) et la présence de sites cryptiques faibles complexifie encore ce transcriptome. 

Projets

Pendant longtemps, l’EA a été considéré comment étant principalement régulé par la présence ou l’absence d’éléments activateurs ou inhibiteurs d’épissage. Il apparait cependant de plus en plus clairement que l’épissage est un processus dynamique faisant intervenir plusieurs niveaux de régulation. De façon similaire il est fort probable que la régulation du transcriptome du VIH au cours de l’infection soit plus complexe qu’anticipée et fasse intervenir de nombreux facteurs cellulaires et/ou viraux. L’objectif de notre équipe est d’approfondir les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de ce transcriptome viral.

Le rôle des protéines Argonaute dans la régulation du transcriptome du VIH

Les protéines (Ago) sont les protéines centrales du complexe miRISC (miRNA induced silencing complex) impliqué dans la régulation post-transcriptionelle d’ARNm via la présence de miARN. En tant qu’éléments clés dans les défenses antivirales, les Ago ont été montrées comme ayant la capacité d’interagir avec l’ARN du VIH-1. Cependant, le rôle de cette interaction dans la régulation de la réplication du virus était débattu. En utilisant un séquençage haut-débit des ARN pontés à la protéine Ago2 (HITS-CLIP), 30 sites de liaisons d’Ago2 à l’ARN viral ont pu être identifiés. Grâce à un système rapporteur, nous avons confirmé quatre sites de liaison situés près de sites donneurs d’épissage. Nos données montrent également que l’inhibition des Ago dans les cellules aboutit à une augmentation des ARN multi-épissés et à une forte réduction de la production de virus. De plus, ce rôle semble indépendant de la présence de miRNA maturés par la protéine Dicer. Dans l’ensemble, notre étude met en évidence un nouveau rôle des protéines Ago dans la régulation du transcriptome du VIH-1 indépendamment de la voie des miARN (Eckenfelder et al, Nucleic Acids Research 2017).

Exploration de la dynamique du transcriptome du VIH-1

Avec une large variété de tailles d’ARN, des combinaisons complexes d’évènements d’épissage distants et un large panel de niveau d’expression, le transcriptome du VIH s’est révélé particulièrement difficile à étudier. Afin de mieux comprendre comment le transcriptome viral est régulé au cours de l’infection, notre équipe, en collaboration avec la plateforme de Génomique de l’IBENS, a récemment mis au point un essai basé sur le séquençage pleine longueur MinION (ONT). En utilisant un pipeline maison, notre travail révèle que le séquençage pleine longueur permet d’identifier et de quantifier les transcrits du HIV générés dans les lymphocytes T CD4+ primaires infectés. En nous basant sur cet essai, nous avons suivi pour la première fois la dynamique des évènements d’épissage régulant la production de toutes les ARN viraux entre 12h et 24h d’infection. Dans l’ensemble ces travaux soulignent que l’EA du VIH est fortement régulé durant les étapes précoces d’infection et propose un outil unique pour saisir cette dynamique (Nguyen Quang et al, Retrovirology 2020).

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Sarah Gallois-Montbrun

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