Sous la direction de Sylvaine You équipe Tolérance, biomarqueurs et thérapie dans le diabète de type 1
Résumé
Les infections par des Entérovirus tels que les Coxsackievirus B (CVB) sont considérées comme des déclencheurs potentiels du diabète de type 1 (DT1). On note une corrélation temporelle entre l’infection par le CVB qui précède la séroconversion des autoanticorps dirigés contre les antigènes de la cellule bêta, et une association spatiale puisque le CVB est retrouvé sur des coupes de pancréas de patients diabétiques. Le CVB possède un tropisme pour la cellule bêta, aboutissant à la lyse de cette dernière. Cependant, on sait très peu de choses sur l’impact précis du CVB, notamment sur la présentation d’épitopes viraux par les molécules du HLA de classe I (HLA-I) et leur reconnaissance par les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (lyT8). Compte tenu des essais de vaccination anti-CVB en cours de développement clinique, il est essentiel de comprendre les mécanismes et le poids relatif de la destruction primaire des cellules bêta médiée par CVB, et de la destruction secondaire induite par les lyT8 anti-CVB, ces derniers pouvant renforcer l’auto-immunité anti-cellule bêta lors de la vaccination.
Dans un premier temps, le laboratoire a identifié les peptides présentés par les molécules HLA-A2 et -A3 exprimées par les cellules bêta humaines (lignée ECN90) infectées par différents sérotypes CVB. Nous avons observé une diminution de l’expression d’HLA-I après infection, associée à la présentation de seulement quelques peptides viraux dérivés de protéines structurelles et non-structurelles (n=17). Par une analyse combinatorielle utilisant des multimères HLA-A2 ou HLA-A3 portant les peptides CVB ainsi identifiés, nous montrons que seule une fraction de ces peptides (30%) est reconnue par des lyT8 provenant du sang de donneurs sains (séropositifs pour CVB), et qu’une sous-fraction est ciblée par les lyT8 effecteurs/mémoire (<50%). De manière intéressante, un épitope CVB homologue à un épitope de la protéine GAD, un auto-antigène majeur du DT1, a été identifié et reconnu par les mêmes lyT8, démontrant ainsi une réactivité croisée. Les peptides immunodominants sont également reconnus par les lyT8 circulants de patients diabétiques (avec des fréquences très faibles, similaires à celles observées chez des donneurs sains), et également isolés à partir de la rate ou de ganglions pancréatiques. Ils expriment le marqueur PD-1, orientant vers un phénotype d’épuisement des lyT8, et partagent des récepteurs d’antigène (TCR) privés avec les tissus périphériques. Pour faciliter l’analyse fonctionnelle des réponses lyT8 anti-CVB, des avatars (ou transductants) T CD8+ ont été générés en faisant exprimer les TCR reconnaissant les peptides CVB dans des lyT8 primaires, puis utilisés dans des tests cytotoxiques d’imagerie en temps réel (IncuCyte). Nous avons observé que les cellules bêta infectées étaient plus efficacement tuées directement par le CVB et dans une moindre mesure par les lyT8 anti-CVB. De plus, l’analyse de la morphologie des cellules bêta infectées a montré la formation de filopodes (projection cytoplasmiques minces) contenant des particules virales, ce qui permettrait de propager l’infection aux autres cellules bêta.
Ainsi, mes travaux montrent que l’infection par le CVB génère une réponse et une mémoire limitées des lyT8 en termes de couverture des épitopes et de fréquence, ce qui pourrait prédisposer aux infections persistantes, associées à la séroconversion des autoanticorps anti-antigènes bêta-cellulaires. La destruction prédominante des cellules bêta par le CVB, favorisée par propagation de l’infection par les filipodes, suggère que le déclenchement de l’auto-immunité anti-cellule bêta reposerait sur un relargage d’auto-antigènes libérés par le virus plutôt que sur des réponses lyT8 antivirales. Ces résultats justifient le renforcement d’une protection immunitaire grâce aux vaccins anti-CVB et fournissent des biomarqueurs pour suivre la réponse à l’infection et à la vaccination tout au long de l’histoire naturelle de la maladie.
Dans un premier temps, le laboratoire a identifié les peptides présentés par les molécules HLA-A2 et -A3 exprimées par les cellules bêta humaines (lignée ECN90) infectées par différents sérotypes CVB. Nous avons observé une diminution de l’expression d’HLA-I après infection, associée à la présentation de seulement quelques peptides viraux dérivés de protéines structurelles et non-structurelles (n=17). Par une analyse combinatorielle utilisant des multimères HLA-A2 ou HLA-A3 portant les peptides CVB ainsi identifiés, nous montrons que seule une fraction de ces peptides (30%) est reconnue par des lyT8 provenant du sang de donneurs sains (séropositifs pour CVB), et qu’une sous-fraction est ciblée par les lyT8 effecteurs/mémoire (<50%). De manière intéressante, un épitope CVB homologue à un épitope de la protéine GAD, un auto-antigène majeur du DT1, a été identifié et reconnu par les mêmes lyT8, démontrant ainsi une réactivité croisée. Les peptides immunodominants sont également reconnus par les lyT8 circulants de patients diabétiques (avec des fréquences très faibles, similaires à celles observées chez des donneurs sains), et également isolés à partir de la rate ou de ganglions pancréatiques. Ils expriment le marqueur PD-1, orientant vers un phénotype d’épuisement des lyT8, et partagent des récepteurs d’antigène (TCR) privés avec les tissus périphériques. Pour faciliter l’analyse fonctionnelle des réponses lyT8 anti-CVB, des avatars (ou transductants) T CD8+ ont été générés en faisant exprimer les TCR reconnaissant les peptides CVB dans des lyT8 primaires, puis utilisés dans des tests cytotoxiques d’imagerie en temps réel (IncuCyte). Nous avons observé que les cellules bêta infectées étaient plus efficacement tuées directement par le CVB et dans une moindre mesure par les lyT8 anti-CVB. De plus, l’analyse de la morphologie des cellules bêta infectées a montré la formation de filopodes (projection cytoplasmiques minces) contenant des particules virales, ce qui permettrait de propager l’infection aux autres cellules bêta.
Ainsi, mes travaux montrent que l’infection par le CVB génère une réponse et une mémoire limitées des lyT8 en termes de couverture des épitopes et de fréquence, ce qui pourrait prédisposer aux infections persistantes, associées à la séroconversion des autoanticorps anti-antigènes bêta-cellulaires. La destruction prédominante des cellules bêta par le CVB, favorisée par propagation de l’infection par les filipodes, suggère que le déclenchement de l’auto-immunité anti-cellule bêta reposerait sur un relargage d’auto-antigènes libérés par le virus plutôt que sur des réponses lyT8 antivirales. Ces résultats justifient le renforcement d’une protection immunitaire grâce aux vaccins anti-CVB et fournissent des biomarqueurs pour suivre la réponse à l’infection et à la vaccination tout au long de l’histoire naturelle de la maladie.
